Tokom procesa in vitro fertilizacije postoji mogućnost da se dobije više vitalnih embriona koji su dobrog kvaliteta, a čiji je broj veći od onog koji par želi za embriotransfer. U tom slučaju se parovima koji prolaze kroz proces vantelesne oplodnje nudi mogućnost krioprezervacije embriona ili tokom rane faze razvoja (2 do 8 ćelija-drugi ili treći dan razvoja embriona) ili u stadijumu blastociste (peti dan razvoja embriona).

Pitanje sa kojim se susreće većina parova je: Koliko dugo su zamrznute jajne ćelije i embrioni dobri i mogu li se oni neprekidno čuvati?

Kratak odgovor na ovo pitanje je: verovatno.

Ali, istina je da je neophodno više istraživanja kako bi se odgovorilo na pitanje o otpornosti ćelija u krioprezerviranom (zamrznutom) stanju. Evo zašto je ovo komplikovanije nego što se prvobitno verovalo.


Foto: Fotolia
 

Tečni azot i posude za čuvanje uzoraka

Kada su šesdesetih godina naučnici po prvi put pokušali da zamrznu embrione sisara, bili su zabrinuti zbog njihovog dugoročnog preživljavanja. Sa druge strane, naučnici su odlučili da embrione sačuvaju u jednoj od najhladnijih sredina – u tečnom azotu. Ovo je zasnovano na pretpostavci da će svi biološki procesi prestati kada se uzorci drže na tako niskim temperaturama.



Tečni azot je gas u tečnom stanju koji isparava i ima vrlo nisku tačku ključanja od -196 stepeni celzijusa. Nasuprot tome, vrlo ga je lako proizvesti, jeftin je, lako se čuva i bezbedan je za transport. Ali tečni azot je koristan samo u posebnim kontejnerima – takozvanim Devarovim posudama u kojima se čuva. Te posude su superizolovani kontejneri pod pritiskom, koji nam omogućavaju čuvanje na duži vremenski period. Tokom svakog dana, samo male količine tečnosti se gube iz ovih posuda zbog isparenja. Ovo minimalno isparavanje se sprečava dodavanjem novih količina tečnog azota.
 

Istorija usporenog zamrzavanja

Četrdesetih i pedestih godina prošlog veka, naučnici su već zamrznuli spermu u tečnom azotu. Bilo je relativno lako zamrznuti spermu koja sadrži ćelije koje su male i koje sadrže malo tečnosti.
 

Zbog čega je ovo važno?

Kada se zamrzne tečnost koja u sebi sadrži vodu dolazi do formiranja kristala leda, koji oštećuju ćelije, čak i na niskim temperaturama. Dakle, zamrzavanje većih ćelija, koje imaju mnogo citoplazme, je mnogo komplikovanije. Najveći izazov je bio zamrznuti jajne ćelije i embrione koji su veće od ostalih ćelija u telu.


Foto: Pixabay

Pa kako onda ovo može da se postigne bez oštećenja?

Embriolozi su uspeli u tome korišćenjem krioprotektanata ili ’’biološkog antifriza’’ pre nego što se polako ohlade u tečnom azotu tokom jednog ili više časova.

Možda mislite da je dodavanje krioprotektanata vašim embrionima ili jajnim ćelijama dobar način da ih ubijete, zar ne? Iako visoke koncentracije krioprotektanata mogu da budu toksične za ćelije, problem se u velikoj meri rešava dodavanjem dovoljne količine koja bi omogućila i preživljavanje ćelija u tečnom azotu i njihovo kratko izlaganje na sobnoj temperaturi. Kako se temperatura postepeno snižava tako se i toksičnost rastvora krioprotektanata smanjuje. Sistem sporog hlađenja i nisikih koncentracija krioprotektanata se uspešno koristi decenijama!


Foto: Wikimedia

Ok, dokazali smo da možemo da zamrznemo i potom odmrznemo embrione miševa. Ali, moramo shvatiti koliko dugo ih možemo držati zamrznutim.

U eksperimentima koji simuliraju izloženost zamrzavanju od 2000 godina, naučnici su dokazali da su embrioni miševa koji su sporo zamrznuti preživeli i najneobičnije uslove.

Ali to su simulacije, a šta se dešava sa stvarnim kliničkim iskustvom?

Kasniji podaci o mišjim embrionima su pokazali da čuvanje embriona u smrznutom stanju nekoliko godina ili čak decenija ima malo uticaja na njihov opstanak nakon odmrzavanja, što znači da se oni i nakon tog vremenskog perioda mogu upotrebiti.



Sledeće logično pitanje koje se nameće je da li se ovo iskustvo odnosi i na ljude?

Širom sveta se u laboratorijama pratilo dugoročno čuvanje embriona, iako su tada embrioni čuvani samo do tri godine. Deca se i danas rađaju bez problema nakon embriotransfera embriona čuvanih i po nekoliko godina. Trudnoća je potvrđena 2010. godine nakon dvadesetogodišnjeg čuvanja embriona u jednoj laboratoriji u Norfolk Virdžiniji.

Ipak, potrebne su detaljnije studije o dugoročnom skladištenju zamrznutih jajnih ćelija i embriona, posebno nakon vitrifikacije (brzog zamrzavanja).
I evo gde bi trebalo da pomenemo da i dalje nemamo dovoljno podataka kako bismo otkrili da li trajanje zamrzavanja embriona i jajnih ćelija utiče na način kako će se potomstvo razvijati.
 

Spas u brzom zamrzavanju?

Uprkos relativnom uspehu, sporo zamrzavanje ljudskih embriona ima glavne nedostatke. Metoda traje dugo, zavisna je od delikatne laboratorijske opreme i ne preživljavaju odmrzavanje svi embrioni i jajne ćelije. Ova ograničenja se prevazilaze vitrifikacijom ili brzim zamrzavanjem.

Vitrifikacija omogućava uzorcima da se zamrznu u roku od jedne sekunde (a ne u roku od jednog do dva sata) bez rizika od stvaranja kristala leda. Ova metoda predstavlja svojevrsnu revoluciju krioprezervacije ljudskih embriona i jajnih ćelija i pojedine laboratorije nakon uvođenja ove metode prijavljuju stopu preživljavanja jajnih ćelija i embriona od čak 100 odsto.


Foto: Wikimedia

Uz tehnološki napredak dolazi i napredak u nauci i medicini, ali i nove brige i ograničenja. U slučaju vitrifikacije, uzorci se mogu držati naizgled sigurni i čuvati se dugo, godinama, ako ne i desetinama godina, ali uzorci moraju ostati bez fizičkih oštećenja i potpuno uronjeni u tečni azot u svakom trenutku.
 

Zbog čega je to nekada problem?

Embriolozi često moraju da samostalno proveravaju i identifikuju uzorke koji su zamrznuti. U najmanjoj meri, to se obavlja jednom godišnje tokom provere inventara ili kadgod se uzorci premeštaju iz laboratorije u laboratoriju. Da bi to postigli, embriolozi moraju da izvade uzorke iz kriotanka dovoljno da bi pročitali obeleženo. Ovo povećava rizik od povišenja temperature.



Grupa argentinskih naučnika je, u teorijskom modelu, nedavno pokazala da vitrifikovani uzorci mogu da izgube svoje zaštitno stanje nalik staklu i pri veoma malim pomeranjima i izlaganju sobnim temperaturama ili kad nema dovoljno tečnog azota u posudama za čuvanje. Za ovaj problem će se pronaći rešenje, ali su neophodna tehnološka rešenja kako bismo metodu nazvali potpuno bezbednom.


Foto: Shutterstock
 

Da li su jajne ćelije i embrioni podjednako osetljivi?

Moguće je, ali ne i dokazano, da su jajne ćelije osetljivije od embriona ako se nepropisno kontrolišu ili obrađuju. Ovo nas vraća na prvobitno postavljeno pitanje.

Mogu li se zamrznute jajne ćelije i embrioni čuvati na neodređeno?

Odgovor, u ovom trenutku, je još uvek – verovatno. Neophodno je da naučnici i inženjeri razviju načine da embriolozi bezbedno čuvaju embrione i jajne ćelije, identifikuju uzorke, obavljaju inventuru i transportuju uzorke bez narušavanja temperature.

Kada se taj cilj postigne, biološki materijal bi mogao da provede čitavu večnost u tečnom azotu i da izađe iz njega bez ijedne ogrebotine. I to ne bi zvučalo kao neverovatna ideja!

B.S.

Reference:
Cohen J, Inge KL, Wiker SR, Wright G, Fehilly CB, Turner TG Jr. Duration of storage of cryopreserved human embryos. J In Vitro Fert Embryo Transf. 1988, 5:301-303.
Dowling-Lacey D, Mayer JF, Jones E, Bocca S, Stadtmauer L, Oehninger S. Live birth from a frozen–thawed pronuclear stage embryo almost 20 years after its cryopreservation. Fertil Steril 2011; 95: 1120.
Liu Q, Lian Y, Huang J, Ren X, Li M, Lin S, Liu P, Qiao J. The safety of long-term cryopreservation on slow-frozen early cleavage human embryos. J Assist Reprod Genet. 2014 Apr;31:471-475.
 

Saznajte sve o metodama vantelesne oplodnje u Češkoj i zakažite razgovor sa lokalnom koordinatorkom u Beogradu! >>>